Аннотация
Флуоресцентные силикатные наночастицы являются перспективными метками для иммунохроматографического анализа благодаря высокой фотостабильности и биосовместимости. В работе представлен синтез силикатных наночастиц (SiNPs), ковалентно модифицированных родамином Б (SiNPs-RhB), методом Штобера с предварительной активацией красителя (3-аминопропил)триэтоксисиланом (APTES). Подобраны оптимальные условия: температура активации 60 °C (2.5 ч), мольное соотношение APTES:TEOS = 1:1, синтез при 50 °C (2 ч), соотношение EtOH:H₂O:NH₃:TEOS = 280.6:67.8:7.4:1. Получены частицы со средним размером (393.8 ± 45.9) нм (DLS, TEM), узким распределением (PDI 0.242) и минимальным вымыванием красителя. Разработанные наночастицы рассматриваются как основа флуоресцентных конъюгатов с антителами для тест-полосок на определение уровня кортизола в слюне человека.
Ключевые слова: силикатные наночастицы, родамин Б, метод Штобера, флуоресценция, иммунохроматография.
1. Введение
Силикатные наночастицы (SiNPs) привлекают внимание благодаря высокой биосовместимости, химической стабильности, низкой токсичности и возможности функционализации поверхности. Эти свойства позволяют использовать их в нефтехимии, доставке лекарств, биовизуализации и иммунохроматографии (Wijewantha N., 2021, Vol. 32, P. 2353). Родамин Б (RhB) – широко применяемый флуоресцентный краситель с высоким квантовым выходом и фотостабильностью, однако его прямое использование в аналитических системах ограничено из-за вымывания и неспецифического связывания (Sarnaik S., 2025, Vol. 10, P. 45417 и Gisbert-Garzarán M., 2021, Vol. 13, P. 9656). Ковалентное закрепление RhB на SiNPs позволяет создать стабильные флуоресцентные наночастицы, пригодные для длительного детектирования (Huang Z., 2024, Vol. 7, P. 3295).
Ключевой подход – предварительная активация RhB с помощью APTES с образованием конъюгата RhB-APTES, который затем соосаждается с тетраэтоксисиланом (TEOS) по методу Штобера (Zanut A., 2020, Vol. 59, P. 21858 и Akhter F., 2022, Vol. 14, P. 8295). В иммунохроматографическом анализе такие наночастицы могут служить контрастными метками для антител, обеспечивая высокую чувствительность и фотостабильность (Quintero-Campos P., 2025, Vol. 192, P. 122 и Xie Q., 2019, Vol. 186, P. 456).
Целью работы является оптимизация синтеза SiNPs-RhB с размером 100–450 нм для применения в иммунохроматографии и оценка их характеристик (интенсивность флуоресценции, размер, PDI, вымывание красителя). Для этого было необходимо провести активацию родамина Б; синтез по Штоберу; очистку; анализ методами флуоресцентной спектроскопии, DLS и TEM.
2. Материалы и оборудование
Родамин Б и аммиак водный (28% NH₃·H₂O) были приобретены у компании «Русский химик». TEOS (≥99%) – у компании «Ареолаб». APTES (≥98%) был приобретён у компании Sigma Aldrich. Этанол абсолютный с содержанием воды менее 1%, перегнанный после обработки CaO (хранение над молекулярными ситами). Вода деионизированная.
3. Методы
3.1. Активация родамина Б с APTES (RhB-APTES)
2.5 мг RhB растворяли в 1.040 мл абсолютного этанола и добавляли 160 мкл APTES. Реакционную смесь (1.200 мл) нагревали при 60 °C в течение 2.5 ч при постоянном перемешивании на магнитной мешалке (Zanut A., 2020, Vol. 59, P. 21858 и Gao X., 2009, Vol. 31, P. 1715). Контроль протекания реакции осуществляли визуально по изменению окраски с тёмно-красной на оранжевую и по сдвигу максимумов флуоресценции. Условия подбирали экспериментально: при T > 60 °C наблюдается гидролиз и соконденсация APTES, при T < 50 °C конверсия неполная.
3.2. Синтез SiNPs-RhB по методу Штобера
В пластиковую пробирку (14 мл) вносили 10 мл этанола и 0.3 мл 28% NH₃·H₂O. Смесь нагревали до 50 °C на термошейкере (Joanlab DBS-5) при постоянном перемешивании со скоростью 600 об/мин. С помощью шприцевого насоса World Precision Instruments модели AL 1010-220Z в течение 60 секунд добавляли 650 мкл раствора этанола, содержащего 150 мкл TEOS. Затем быстро вводили 1.125 мл раствора RhB-APTES. Смесь выдерживали в течение 2 ч при постоянном перемешивании со скоростью 600 об/мин, поддерживая температуру 50 °C (Stöber W., 1968, Vol. 26, P. 62). Мольное соотношение реагентов: EtOH:H₂O:NH₃:TEOS = 280.6:67.8:7.4:1. APTES:TEOS = 1:1 (по молям). Получали 12 мл суспензии SiNPs-RhB.
3.3. Очистка
Суспензию центрифугировали 15 мин при 14000 об/мин (4 °C), супернатант отбирали. Осадок редиспергировали в 3 мл этанола на УЗ-ванне. Данный цикл повторяли четыре раза. Супернатанты (0–3) и конечную суспензию анализировали методом молекулярной флуоресцентной спектроскопии. Массовая концентрация очищенных SiNPs-RhB – (10.0 ± 0.2) мг/мл.
3.4. Флуоресцентная спектроскопия
Спектры излучения образцов регистрировались на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi F-7100 (Токио, Япония) с вогнутой дифракционной решеткой. Спектры излучения регистрировались в областях 525–700 нм со следующими параметрами: длина волны возбуждения λ_ex = 555 нм, напряжение 400 В, щели на вход и на выход – по 2.5 нм. Анализировали супернатанты 1–3 и разбавленную (в 100 раз) суспензию SiNPs-RhB.
3.5. Динамическое светорассеяние (DLS)
Эксперименты по динамическому рассеянию света (DLS) были проведены на приборе Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Великобритания). Экспериментальные автокорреляционные функции были проанализированы с помощью программного обеспечения Malvern DTS и методов разложения кумулянта второго порядка. Средняя погрешность составила около 4%. Все образцы были приготовлены в абсолютном этаноле. Все измерения проводились четыре раза при 25 °С.
3.6. Просвечивающая электронная микроскопия (TEM)
Образцы были приготовлены следующим образом: капля объемом 6 мкл была взята из середины свежеприготовленного раствора с помощью дозатора (Biohit Proline Plus, Göttingen, Германия) и нанесена на медную сетку размером 300 меш с помощью углерод-формварной пленки-носителя (Agar Scientific, Essex, CM24 8GF, Великобритания). Капля полностью покрывает сетку. Процесс пробоподготовки осуществляется при комнатной температуре. Далее образец высушивают в муфельной печи при 80 °С. ПЭМ-изображения получены с помощью просвечивающего электронного микроскопа Hitachi HT7700 (Япония) при ускоряющем напряжении 100 кВ в состоянии прямого наблюдения (Faizullin B.A., 2025, Vol. 321, P. 146540).
4. Результаты и обсуждение
4.1. Оптимизация активации RhB-APTES
Реакция образования RhB-APTES через амидную связь эффективно протекает при 60 °C, 2.5 ч. При 20 °C через 2 ч конверсия незначительна – практически весь краситель вымывается при очистке. Увеличение времени до 3 ч приводит к росту вымывания из-за побочной соконденсации APTES. Цвет смеси меняется с тёмно-красного на оранжевый, что косвенно подтверждает протекание реакции (Gao X., 2009, Vol. 31, P. 1715). Более существенное доказательство представлено в главе 4.2.
4.2. Синтез и очистка SiNPs-RhB
После синтеза наблюдается опалесценция суспензии, что является характерным признаком образования наночастиц. Очистка центрифугированием эффективно удаляет несвязанный RhB. Флуоресцентный анализ супернатантов (рис. 1) показывает, что после трёх циклов промывки интенсивность эмиссии (λ_em = 576 нм) падает до фонового сигнала, при этом пик на длине волны 555 нм соответствует мелкой фракции SiNPs (5–10 нм), а не свободному RhB. Это доказывает ковалентное закрепление красителя.

Наблюдается сдвиг максимума эмиссии с 576 нм (свободный RhB) до 570 нм (SiNPs-RhB), что характерно для изменения микроокружения флуорофора.
4.3. Влияние температуры и длительности синтеза
Синтез Штобера при температуре 20 °C даёт крупные агрегаты со средним размером d_av = (1970 ± 472) нм и PDI = 0.571 ± 0.142. Повышение до 50 °C снижает размер до (932.2 ± 44.4) нм и PDI до 0.420 ± 0.035. Мольные отношения реагентов и растворителей составили APTES:TEOS = 1.5:1, EtOH:H₂O = 1.66:1. Экспериментально было выяснено, что длительность синтеза влияет на сшивку SiNPs-RhB: при 2 ч вымывание RhB в 9 раз меньше, чем при 0,5 ч, но за 2.5–3 ч оно снова возрастает из-за гидролиза APTES. Дальнейшая оптимизация соотношения компонентов и подбор оптимальных условий для синтеза (2 ч при 50 °C) позволили достичь целевого диапазона 100–450 нм.
4.4. Влияние мольного отношения APTES:TEOS
Увеличение избытка APTES уменьшает вымывание, но вызывает агрегацию. Оптимальное соотношение APTES:TEOS составило 1:1 (по молям), при этом PDI образующихся наночастиц в образце 4 равен 0.242 (табл. 1). При отношениях 0.75:1 вымывание выше, а при 1.25:1 размер уменьшается (d_num ≈ 208 нм), но PDI возрастает до 0.373.

4.5. Влияние соотношения EtOH:H₂O
Увеличение мольного отношения EtOH:H₂O (при постоянном количестве NH₃ и TEOS) линейно уменьшает размер частиц. Для достижения целевого диапазона (100–450 нм) выбрано отношение 4.14:1.
4.6. Характеризация полученных SiNPs-RhB
В оптимизированных условиях (активация 60 °C, 2.5 ч; синтез 50 °C, 2 ч; APTES:TEOS = 1:1; EtOH:H₂O = 4.14:1) получены частицы сферической формы (рис. 4) со следующими характеристиками: d_num = (393.8 ± 45.9) нм, d_av = (494.6 ± 44.0) нм, PDI = 0.242 ± 0.028. Устойчивое свечение после четырёх циклов центрифугирования и отсутствие вымывания свободного красителя подтверждают факт ковалентного закрепления RhB на SiNPs.

Полученный размер (393.8 нм) полностью укладывается в требуемый диапазон 100–450 нм, а низкий PDI свидетельствует о монодисперсности. Такие наночастицы пригодны для конъюгации с антителами через карбоксильные или аминогруппы поверхности (Xie Q., 2019, Vol. 186, P. 456 и Bandara A.B., 2015, Vol. 70, P. 433).

5. Применение в иммунохроматографии
Иммунохроматографический анализ требует флуоресцентных меток с высокой интенсивностью, фотостабильностью и возможностью ковалентной пришивки антител (Quintero-Campos P., 2025, Vol. 192, P. 122 и Xie Q., 2019, Vol. 186, P. 456). SiNPs-RhB превосходят свободный RhB по яркости (до 10–100 раз на частицу) и стабильности. Поверхность SiNPs легко функционализируется через силанольные группы или остатки APTES (Xie Q., 2019, Vol. 186, P. 456) для связывания с белками (например, через глутаровый альдегид или EDC/NHS). В работе показано, что при оптимальном выборе условий синтеза вымывание красителя отсутствует, удовлетворяя критическому требованию для количественного анализа. Таким образом, синтезированные наночастицы являются перспективной основой для тест-полосок на вирусы, гормоны и сердечные маркеры (Natarajan S., 2021, Vol. 11, P. 49, Xie Q., 2019, Vol. 186, P. 456 и Bandara A.B., 2015, Vol. 70, P. 433).
6. Выводы
1. Оптимизирована стадия активации родамина Б APTES: T = 60 °C, время 2.5 ч в этаноле. Более низкие температуры дают неполную конверсию, а более высокие приводят к гидролизу органического силана.
2. Разработан метод синтеза SiNPs-RhB по Штоберу с совместной конденсацией TEOS и RhB-APTES. Оптимальные условия: T = 50 °C, время 2 ч, мольное соотношение EtOH:H₂O:NH₃:TEOS = 280.6:67.8:7.4:1; APTES:TEOS = 1:1.
3. Получены стабильные наночастицы с размером d_num = (393.8 ± 45.9) нм, PDI = 0.242, что подтверждено DLS и TEM.
4. Методом флуоресцентной спектроскопии доказано ковалентное закрепление RhB: после четырёх циклов центрифугирования сигнал свободного красителя отсутствует.
5. Синтезированные SiNPs-RhB полностью соответствуют требованиям для иммунохроматографических меток: фотостабильность, размер в диапазоне 100–450 нм.
6. В дальнейшем рассматривается возможность конъюгации с антителами на кортизол.
Благодарности
Работа выполнена в Химическом институте им. А.М. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета и Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова. Авторы благодарят научных руководителей: доцента Заирова Р.Р., доцента Гедмину А.В. и аспиранта Корнева Т.А.